一個成年人體內(nèi)大約有37.2萬億細胞，對這些生命的基本單位，人類至今還沒有像掌握基因“密碼本”一樣，擁有一份來自細胞的全“圖譜”。“這個細胞總數(shù)是一個巨大的數(shù)字，但對人體細胞分類，以及對細胞各自功能的研究，對人類疾病治療非常重要?！?/p>

近日，深圳華大生命科學研究院劉龍奇在接受澎湃新聞（www.thepaper.cn）記者專訪時表示，現(xiàn)階段而言，人類細胞圖譜的全面解析仍存在多項挑戰(zhàn)，他們近年來將目光聚焦到和人的基因相似度高達93%的食蟹獼猴（Macaca fascicularis）。來自6個國家的35個科研團隊首次展示了這一非人靈長類動物（NHP）的大規(guī)模細胞轉(zhuǎn)錄組圖譜。

該研究于4月13日晚間在線發(fā)表于頂級學術(shù)期刊《自然》（Nature），題為“非人類靈長類獼猴的細胞轉(zhuǎn)錄組圖譜”（ Cell transcriptomic atlas of the non-human primate Macaca fascicularis）。研究由深圳華大生命科學研究院聯(lián)合北京華大生命科學研究院、深圳國家基因庫、吉林大學、中國科學院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院、瑞典卡羅林斯卡醫(yī)學院、英國劍橋大學、西班牙ICREA研究所、新加坡ASTAR等來自6個國家的研究團隊聯(lián)合完成。

“這個圖譜就像一張‘地圖’，有了它就相當于有了一個探索生命細胞分辨率的高精度儀器，可以‘看到’每個器官都有哪些細胞，還可以精細到每個細胞里具體的分子特征及與其他細胞的互作關(guān)系。”該論文第一作者、深圳華大生命科學研究院韓磊博士介紹說，“這為我們更好地認識生命的基本結(jié)構(gòu)，探究疾病和細胞的關(guān)系打下了基礎(chǔ)，也為疾病的精準治療提供了新的方向?！?/p>

中科院腦科學與智能技術(shù)卓越創(chuàng)新中心主任蒲慕明院士也分析了此項研究在生物學和應(yīng)用上的重要意義。他認為，作為臨床藥物研發(fā)重要的模式動物，未來五到十年，食蟹猴各種疾病模型將不斷出現(xiàn)?！敖裉飓@得的數(shù)據(jù)就是一個最好的基礎(chǔ)，是藥物研發(fā)最好的數(shù)據(jù)庫，是非常重要的一個里程碑?！?/p>

值得關(guān)注的是，研究團隊還搭建了非人靈長類動物百萬單細胞的資源網(wǎng)站NHPCA (https://db.cngb.org/nhpca/)。該數(shù)據(jù)庫開放且具有交互式特征，劉龍奇對澎湃新聞記者表示，“可以實現(xiàn)用戶自行探索，也可以實現(xiàn)用戶數(shù)據(jù)和我們數(shù)據(jù)的整合?！?/p>

他強調(diào)，上述理念非常重要，也是未來細胞圖譜領(lǐng)域的大趨勢?！霸谖磥砑毎麍D譜體量越來越大的情況下，如何整合不同平臺、不同實驗室的數(shù)據(jù)是非常重要的。而如何把數(shù)據(jù)庫建得更好，本身也是一個很重要的學問。”

深圳華大生命科學研究院劉龍奇博士。

人類細胞圖譜挑戰(zhàn)

攜帶著遺傳物質(zhì)的細胞，我們?nèi)绾胃Q探其奧秘？把細胞放置在顯微鏡下，可以觀察到其形態(tài)和結(jié)構(gòu)，然而科學發(fā)展至今，科學家們想在分子水平上解析細胞與細胞之間的細微差別。

單細胞測序技術(shù)的出現(xiàn)為深入“閱讀”細胞帶來了前所未有的機會。2009年，湯富酬（現(xiàn)任北京未來基因診斷高精尖創(chuàng)新中心研究員、北京大學生命科學學院BIOPIC中心教授）在博士后期間即發(fā)表了世界上第一篇單細胞mRNA測序的文章，實現(xiàn)了“從0到1”的跨越。這次重要的嘗試開啟了單細胞轉(zhuǎn)錄組測序的時代。

而近年來，高通量單細胞測序技術(shù)的發(fā)展也催生了“人類細胞圖譜”（Human Cell Atlas）的提出。該計劃提出之初主要由英美科學家主導，2017年10月，美國麻省理工學院-哈佛大學博德研究所的計算生物學家Aviv Regev、英國威康信托桑格研究所細胞遺傳學負責人Sarah A. Teichmann在論文預(yù)印本平臺bioRxiv發(fā)表了一篇文章，文章標題即為“The Human Cell Atlas”，系統(tǒng)論述了HCA的意義、目標、任務(wù)和實施路徑。而在公開發(fā)表該文章的近一年之前，Regev等人在英國倫敦已召開了一次關(guān)于該計劃的會議。

浙江大學醫(yī)學院干細胞與再生醫(yī)學中心教授郭國驥此前在接受澎湃新聞（www.thepaper.cn）記者采訪時表示，作為生命科學領(lǐng)域近年來興起的國際大科學計劃，“人類細胞圖譜計劃旨在描述人體中每個細胞的詳細特征，呈現(xiàn)不同類型細胞在人體組織的3D結(jié)構(gòu)，勾勒所有人體系統(tǒng)的相互聯(lián)系，揭示圖譜變化與健康和疾病的關(guān)系。人類細胞圖譜計劃將徹底改善人們對疾病的理解、診斷和治療。”

此前的2020年3月，郭國驥等人在《自然》發(fā)表了一項研究成果，他們對60種人體組織樣品和7種細胞培養(yǎng)樣品進行了Microwell-seq高通量單細胞測序分析，系統(tǒng)性地繪制了跨越胚胎和成年兩個時期，涵蓋八大系統(tǒng)的人類細胞圖譜。郭國驥彼時表示，這項研究工作構(gòu)建了人類細胞圖譜的基本框架，對未來圖譜的進一步完善具有指導性意義。

然而，截至目前，人類細胞圖譜的構(gòu)建仍充滿挑戰(zhàn)。劉龍奇對澎湃新聞記者表示，“其中最大的挑戰(zhàn)就在于當前工具的通量和成本，這也是最直接的難點?！比绻凑丈虡I(yè)工具來算，測一個細胞的成本為幾塊錢，“對37萬億個細胞進行測序的成本是非常高的，不可能支撐?！?/p>

成本帶來的限制還在于，相比于1990年正式啟動的人類基因組計劃（HGP），人類細胞圖譜計劃當前并沒有固定的經(jīng)費支持，“人類基因組計劃相對來說經(jīng)費比較固定，而人類細胞圖譜計劃現(xiàn)在是由各個科學家籌集經(jīng)費，這一點帶來很大的挑戰(zhàn)。”

第二點挑戰(zhàn)則在于項目目標不是特別明確?！敖M織相對自由，每個人有自己的研究計劃，不同人的分工可能也很難做到很明確，當前都是大家根據(jù)各自感興趣的方向來做?！眲埰嬲J為，整體而言，人類細胞圖譜計劃目前還沒有做到明確的目標和任務(wù)分工。

第三大挑戰(zhàn)還在于各實驗室之間的“壁壘”。“目前這個階段，不同的實驗室使用的工具可能會有差異，最終的結(jié)果是給大家之間的數(shù)據(jù)共享和分析挖掘帶來不同的挑戰(zhàn)?！边@也源于當前整個該領(lǐng)域的工具還沒有非常成熟。

自主可控的工具先行

劉龍奇所在的深圳華大生命科學研究院主導的這項最新研究先將目光投向了和人的基因相似度高達93%的食蟹獼猴。

研究團隊在論文中寫道，考慮到進化上的接近性，非人類靈長類動物(NHPs)代表了最接近人類的選擇。構(gòu)建一份非人類靈長類動物細胞圖譜(NHPCA)將產(chǎn)生一份可用于研究人類生理、疾病和衰老的特征目錄。這也將為人類和非人類靈長類動物之間不同身體功能的進化機制提供洞見。

當然，非人類靈長類動物也包括一個龐大而多樣的物種群體，它們在生態(tài)、飲食、運動和行為方面都有很大的差異。鑒于更頻繁的生殖周期、更廣泛的分布等特點，特別是食蟹獼猴，其在全球常被用于以科研為目的的研究。

劉龍奇也表示，“從基因組序列來看，獼猴和人的差異相比小鼠等模式動物要小很多，這是選擇猴的第一個原因；第二，如果想真正了解人類的疾病，比如帕金森、阿爾茲海默癥等，你不能在人身上直接做研究，我們必須構(gòu)建動物疾病模型，非人靈長類尤其在認知和神經(jīng)系統(tǒng)疾病研究中具有顯著優(yōu)勢?！?/p>

劉龍奇談到，目前這類數(shù)據(jù)較少，獼猴還是一個空白，“所以這些數(shù)據(jù)的發(fā)布對于未來進行一系列的研究都非常重要，包括疾病機制理解、藥物篩選等?！?/p>

單細胞建庫系統(tǒng)DNBelab C4。

這項研究中的所有實驗都使用了單細胞建庫系統(tǒng)DNBelab C4，以及DNBSEQ系列測序平臺。劉龍奇認為，在成本太高難以支撐的情況下，“工具突破是首先必須要解決的問題。”?DNBelab C4即由華大智造自主研發(fā)，于2019年10月正式對外發(fā)布。此外華大智造自主擁有DNBSEQ系列測序平臺，“我們在構(gòu)建細胞圖譜時已經(jīng)有了非常顯著的優(yōu)勢，從上游的建庫到下游的測序，在工具上已經(jīng)全面掌控了?！?/p>

DNBSEQ測序平臺。

而如何從組織器官分離到細胞圖譜產(chǎn)生？劉龍奇介紹道，對于用單細胞核RNA測序(snRNA-seq)分析的樣本，采集后首先被保存至液氮（-190℃）中，直至進行細胞核提取。用密度梯度離心法獲得較純的細胞核，單細胞（核）懸液制備好后，通過DNBelab C4，細胞核被包裹成液滴，在液滴中完成細胞裂解及微珠捕獲mRNA，有效回收微珠后，在單管中完成反轉(zhuǎn)錄、cDNA合成，根據(jù)高通量測序流程制備文庫并進行測序及生信分析。

“其實單細胞工具做的就是一件事，給每個單細胞核打上一個DNA標簽，就像二維碼一樣，打完標簽的細胞放到一起，我們就可以進行下一步的建庫和測序。測完序之后我們根據(jù)標簽去區(qū)分每個細胞，通過這樣的過程我們就可以生成一個細胞圖譜?！眲埰孢M一步形象地解釋道。

這項研究中一處令人關(guān)注的細節(jié)是，少數(shù)組織樣本采用了過去常用的單細胞RNA測序(scRNA-seq)技術(shù)，而大多數(shù)組織則采用了單細胞核RNA測序(snRNA-seq)進行圖譜分析。

劉龍奇解釋稱，“首先，雖然大部分mRNA是在細胞質(zhì)里面，但是mRNA是從細胞核里面轉(zhuǎn)錄出來，細胞核里面依然有很多的mRNA，所以從理論上來說這是可行的?！?/p>

另一個關(guān)鍵的原因在于單細胞核RNA測序?qū)颖咎幚怼胺浅Ｓ押谩薄埰嫣岬?，這項研究涉及到45個器官和組織，大多器官的樣本解離上策略不一，針對每個細胞需要進行方法優(yōu)化，而且當研究人員在分析全細胞的時候，一個器官里面細胞大小有差異，“比如肝，肝實質(zhì)細胞較大，免疫細胞又非常小，所以在組織解離的過程中，按照傳統(tǒng)的方法很容易丟掉一些細胞?！绷硗猓谝旱伟夹g(shù)的單細胞工具對于細胞大小較為敏感，“大的細胞很難包裹，小的細胞比較容易包裹，這些都會帶來非常明顯的偏好性?！?/p>

總體來說，細胞核大小幾乎固定，在1微米左右，這一點消除了數(shù)據(jù)的偏好性。此外，無論多少個器官，研究團隊可用統(tǒng)一的方法去分離提取，因此也消除了樣本處理帶來的影響。“我們把這些影響降到最低?！碑斎?，對胰腺這樣的組織，本身也難以分離出高質(zhì)量的細胞，較為穩(wěn)定的細胞核是唯一選擇。

對于骨髓這樣的游離細胞，研究團隊仍然采用了單細胞RNA測序?！肮撬璧募毎w來說非常小，提核相對來講比其他組織難度大一點，但是分離細胞非常容易?！?/p>

據(jù)劉龍奇介紹，對于單細胞測序和單細胞核測序，研究團隊進行了系統(tǒng)的分析，“有些細胞我們既做了細胞又做了細胞核，從全局角度來看，它們的一致性大概是在90%-95%之間。但是，當你看單個基因的時候，可能細胞跟細胞核在某些基因表達上有差異?！?/p>

研究團隊認為，這項研究的結(jié)果也證實了單細胞核RNA測序用于生成大規(guī)模細胞圖譜的實用性。

全球首個非人靈長類動物全細胞圖譜

研究團隊最終基于華大自主研發(fā)的單細胞建庫和測序平臺，對成年獼猴的45個器官的約114萬個細胞進行了單細胞測序分析。將其分成了113種主要的細胞類型和463種細胞亞類。

這也是全球首個非人靈長類動物全細胞圖譜?！皩嶋H上還可以繼續(xù)細分，就看研究人員希望得出多大的顆粒度，理論上可以分出上千上萬種，只要能理解細胞的功能是什么?！眲埰嬲J為，細胞的精細分類是后續(xù)很多研究工作的基礎(chǔ)。

食蟹獼猴細胞圖譜。

目前這張獼猴圖譜為我們提供了哪些信息？研究團隊選取了一些重要研究話題進行了初步的探索。其中包括，基于該圖譜，他們構(gòu)建了包含新冠、乙肝、狂犬病毒等126種病毒易感細胞類型的病毒數(shù)據(jù)庫。這就像一本“病毒字典”，可以通過它快速查詢病毒最有可能侵染的細胞類型，同時看到該細胞類型可能分布的器官。

尤其值得關(guān)注的是，鑒于COVID-19大流行仍在全球蔓延，這項研究集中研究了新冠病毒（SARS-CoV-2）的受體ACE2（血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2）和TMPRSS2（跨膜絲氨酸蛋白酶2）。此前的多項研究已經(jīng)證明，SARS-CoV-2進入宿主細胞是通過刺突蛋白（S蛋白）與細胞表面的ACE2結(jié)合，以及TMPRSS2裂解S蛋白而啟動的。ACE2被比作為病毒入侵的“門鎖”，TMPRSS2則被視作“潤滑油”。

這項研究評估了它們在獼猴組織中的表達。它們分析發(fā)現(xiàn)，TMPRSS2在獼猴的多個組織中廣泛表達，ACE2的表達相對受限。ACE2在膽囊(粘液細胞、內(nèi)皮細胞、腺細胞和平滑肌細胞)、睪丸支持細胞、腎上皮細胞(主要是近端小管細胞)、肺(纖毛細胞、棒狀細胞，特別是肺泡2型細胞)和肝臟(肝細胞，尤其是膽管細胞)中表達最高。

此前有研究認為，ACE2+TMPRSS2+雙陽性細胞對SARS-CoV-2感染的風險較高。研究團隊注意到，這些細胞在獼猴膽囊細胞中數(shù)量最多，這也與COVID-19患者發(fā)生急性膽囊炎的報道一致。而在肺和腎細胞中也觀察到相當多的共表達，在其他細胞類型如膀胱上皮細胞、胰管和胰島細胞中則觀察到較少的共表達。

接下來，研究團隊還對猴子和人類ACE2和TMPRSS2的表達進行了比較分析。結(jié)果顯示，在這兩個不同的物種中，肝臟的模式相似，而膽囊、腎臟和肺的模式更為不同。

他們在討論環(huán)節(jié)就此分析，這項研究表明，獼猴和人類之間比較發(fā)現(xiàn)，ACE2和TMPRSS2在不同細胞類型中的表達分布并不相同?！斑@可能會影響SARS-CoV-2的發(fā)病機制研究，并可能解釋為什么羥氯喹等藥物盡管在體外猴細胞系中提供了有希望的結(jié)果，但在人類中卻無效?！?/p>

當然，這樣的例子也同樣提醒，人類和獼猴之間存在靶細胞易感性的差異，盡管在神經(jīng)系統(tǒng)疾病等方面，獼猴相比小鼠是更優(yōu)的模式動物，但仍需謹慎對待實驗結(jié)果。

研究還提到，除了ACE2和TMPRSS2，許多其他分子也參與了促進SARS-CoV-2與細胞表面的結(jié)合或COVID-19的發(fā)病機制?！八鼈冊讷J猴組織中的表達或共表達、其他關(guān)聯(lián)和病毒與宿主的相互作用，以及物種間的差異，都可以通過NHPCA網(wǎng)站進行研究?！?/p>

劉龍奇談到，新冠只是一個典型的例子，“我們構(gòu)建了整個病毒易感的數(shù)據(jù)庫，大家可以根據(jù)這個數(shù)據(jù)庫得到乙肝病毒、狂犬病毒等對應(yīng)的受體在什么器官里面存在，為疾病的臨床診斷和治療指明方向?！?/p>

值得一提的是，這項研究在華大團隊的主導下，由來自6個國家35個研究團隊共同完成。

“研究覆蓋了45個器官，每個器官都是非常復雜的，很難說有哪一個獨立的團隊會對每一個器官都非常熟悉，所以我們跟國際上很多非常頂尖的團隊合作，去進行聯(lián)合解讀?！眲埰媾e例道，對腎這一器官，團隊和腎臟病領(lǐng)域著名專家、劍橋大學臨床醫(yī)學院院長Patrick Maxwell教授合作，“確保我們充分理解這個器官中獲得的信息?！?/p>

劉龍奇認為，這種全球合作的方式，特別是通過大科學計劃組織的方式去進行聯(lián)合解讀，“這應(yīng)該是未來細胞圖譜發(fā)展的重要策略。”

研究團隊同時創(chuàng)建了數(shù)據(jù)庫。“圖譜作為基本的數(shù)據(jù)，我相信國際上會有很多人使用這個圖譜進行數(shù)據(jù)的挖掘，我們現(xiàn)在也收到了很多這方面的需求，現(xiàn)在的數(shù)據(jù)也都是公開的?！眲埰嬲劦?，“首先，數(shù)據(jù)的體量是非常大的，一般的科研用戶接觸你的數(shù)據(jù)的方式，可能就是依賴一個很明確的數(shù)據(jù)庫。”

此外，這一數(shù)據(jù)庫是交互式的?！安还芏欢當?shù)據(jù)分析，你都可以通過鼠標點擊去探索，我們現(xiàn)在建的是一個非常全的數(shù)據(jù)庫，一方面涉及到整個數(shù)據(jù)的展示，另一方面用戶對于他感興趣的基因、疾病的表型等，都可以通過這個數(shù)據(jù)進行探索選擇?！眲埰姹硎尽?/p>

劉龍奇同時表示，單細胞測序領(lǐng)域，仍在期待在成本、性能等方面具有“降維打擊”式效應(yīng)的技術(shù)和工具出現(xiàn)。全球研究團隊更好的合作，以及人類細胞圖譜的實現(xiàn)，或許都在期待下一個質(zhì)的飛躍。